HMC-1 人肥大細(xì)胞 HMC1
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使用前請仔細(xì)閱讀說明書，如有任何問題，請**時(shí)間與銷售人員聯(lián)系！
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細(xì)胞名稱
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HMC-1 人肥大細(xì)胞
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貨 號(hào)
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XY-XH5987
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細(xì)胞來源
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國際引進(jìn)
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細(xì)胞形態(tài)
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**母細(xì)胞樣
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生長方式
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懸浮生長
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描 述
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來源于一名 52 歲男性肥大細(xì)胞白血病患者的外周血樣本。該細(xì)胞有多重亞型分別為：HMC-1 5C6，HMC-1.1 ，HMC-1.2 。廣泛用于人肥大細(xì)胞功能研究，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出組織肥大細(xì)胞的許多關(guān)鍵特征，例如組胺、類胰蛋白
酶、肝素和類似細(xì)胞表面抗原譜的表達(dá) （1,2）。受體酪氨酸激酶 KIT 在肥大細(xì)胞上表達(dá)，在肥大細(xì)胞的增殖、功能和存活中起重要作用。KIT 中的激活突變與肥大細(xì)胞生長失調(diào)有關(guān)，并與肥大細(xì)胞腫瘤和系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增
多癥有關(guān)。據(jù)報(bào)道，HMC-1 細(xì)胞系中存在兩個(gè) KIT 激活點(diǎn)突變 。這兩種突變都將受體轉(zhuǎn)化為組成型酪氨酸磷酸化和活性狀態(tài)，導(dǎo)致生長因子非依賴性增殖。HMC-1.1 （HMC-1（560）） 和 HMC-1.2 （HMC-1（560,816）） 是HMC-1 細(xì)胞系的兩個(gè)變異亞系。HMC-1.1 具有 V560G 突變，但不具有 D816V 突變。HMC-1.2 同時(shí)具有 V560G 和D816V 突變，并且表現(xiàn)出比 HMC-1.1 更高的增殖率。有人認(rèn)為，HMC-1.2 的較高增殖潛力可能歸因于 D816V 突變。
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培養(yǎng)條件
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IMDM培養(yǎng)基；上等胎牛血清，10%；雙抗，1%。；
氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%
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換液頻率
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2-3天
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傳代比例
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**傳代建議1:2
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凍存液配方
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無血清細(xì)胞凍存液（XYC90100）
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備 注
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運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。 收到細(xì)胞后**次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。
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供應(yīng)限制
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僅供研究之用。
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細(xì)胞圖片
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照片版來源于德國默克
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運(yùn)輸和保存：
干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
細(xì)胞接收后的處理：
1）收到細(xì)胞后，75%酒精**瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2）請?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。
3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。
細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。**天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
懸浮細(xì)胞參考：
大多數(shù)懸浮細(xì)胞對于環(huán)境比較敏感，建議一直維持高密度生長，一般情況下細(xì)胞密度維持在 1×10 5 到 1×10 6個(gè)/mL（不同細(xì)胞對密度要求不同）。如需分瓶可以將細(xì)胞懸液收集到離心管中 800-1000rpm，離心 5min，棄去上清，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按 1：2 的比例（**可以 1:1 分瓶）分到新 T25 瓶中，添加5-6ml 按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按 1:2 和以上比例進(jìn)行。大多數(shù)血液類相關(guān)的懸浮細(xì)胞受運(yùn)輸影響比較大，會(huì)出現(xiàn)一批死細(xì)胞，如果因此密度降低了，可以離心后轉(zhuǎn)移至 T25 瓶中豎著培養(yǎng)，培養(yǎng)基添加 5ml 以提高總體密度，隔**后觀察密度可以的話再補(bǔ)液 3ml 完全培養(yǎng)基后 T25 瓶放倒，等沉淀穩(wěn)定后觀察細(xì)胞密度，持續(xù)添加培養(yǎng)基等密度上升足夠傳代為止。
3）細(xì)胞凍存:
收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例；
1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.
2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
注意事項(xiàng)：
1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物**臺(tái)內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要**后方能丟棄。
2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造傷害。
細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及解決方法
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問題
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原因
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解決方案
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細(xì)胞生長緩慢
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生長培養(yǎng)基使用不當(dāng)
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按照生產(chǎn)商的建議，使用相應(yīng)的預(yù)熱生長培養(yǎng)基。
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生長培養(yǎng)基中血清質(zhì)量差
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使用其他批次血清。
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傳代操作不當(dāng)
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按照生產(chǎn)商的建議消化時(shí)間及傳代比例進(jìn)行操作。
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換液過于頻繁
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降低換液頻率，參考生產(chǎn)商推薦的換液頻率。
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細(xì)胞傳代次數(shù)過多
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使用傳代次數(shù)較少的健康細(xì)胞。
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細(xì)胞生長超過匯合狀態(tài)
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哺乳動(dòng)物細(xì)胞傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對數(shù)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行，建議細(xì)胞密度達(dá) 80-90%傳代。
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細(xì)胞被支原體污染
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將細(xì)胞、培養(yǎng)基和試劑丟棄；新取一只凍存細(xì)胞，并且使用新的培養(yǎng)基和試劑。
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細(xì)胞復(fù)蘇存活率低
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細(xì)胞凍存不當(dāng)
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新取一只凍存細(xì)胞，并儲(chǔ)存在液氮中。將細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，直至復(fù)蘇。
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自行制備的凍存細(xì)胞無活性
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將細(xì)胞按照生產(chǎn)商推薦的密度凍存。
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制備凍存細(xì)胞時(shí)使用傳代次數(shù)少的細(xì)胞。
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嚴(yán)格按照生產(chǎn)商推薦的操作程序凍存細(xì)胞。請注意本手冊推薦的冷凍程序是凍存細(xì)胞的一般流程，只能作為指導(dǎo)原則使用。
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新取一只凍存細(xì)胞。
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細(xì)胞復(fù)蘇方法不當(dāng)
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嚴(yán)格按照生產(chǎn)商推薦的操作程序復(fù)蘇細(xì)胞。請注意本手冊推薦的解凍程序是復(fù)蘇細(xì)胞的一般流程，只能作為指導(dǎo)原則使用。
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確保冷凍細(xì)胞解凍迅速，接種前用預(yù)熱的生長培養(yǎng)基緩慢稀釋細(xì)胞。
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復(fù)蘇培養(yǎng)基使用不當(dāng)
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使用生產(chǎn)商推薦的培養(yǎng)基。確保培養(yǎng)基使用前已經(jīng)預(yù)熱。
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細(xì)胞稀釋過度
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按照生產(chǎn)商的建議，將解凍后的細(xì)胞高密度接種，以改善復(fù)蘇效果。
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處理細(xì)胞時(shí)動(dòng)作不夠輕柔
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凍存和復(fù)蘇過程對大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)造成不利影
響。不要通過渦旋振蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細(xì)胞脫落(培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞時(shí)除外)，也不要高速離心細(xì)胞。
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凍存液中所用保護(hù)劑在儲(chǔ)存過程中未避光
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如果未避光儲(chǔ)存，凍存保護(hù)劑會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?xì)胞有毒性的物質(zhì)；新取一只凍存保護(hù)劑，重新凍存細(xì)胞。
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